Yeni Nesil Sekanslama (YNS) teknolojisi diye adlandırdığımız şey aslında kendi içerisinde birçok farklı teknolojik yaklaşımı içeriyor, bunların neler olduklarından daha önce bahsetmiştim. Bu yazıda temel olarak YNS'nin çalışma prensiplerinden ve kütüphane hazırlama yöntemlerinden bahsedeceğim.
Sekanslama öncesi ilk yapmamız gereken şey organizmaların DNA'sını izole etmek. Maalesef henüz bu aşamayı ortadan kaldıran bir teknoloji yok. Ancak YNS için yapmamız gereken hazırlık bununla bitmiyor: genelde bu teknolojinin anlaşılması ve uygulaması en güç kısmı da burası. İzole edilen DNA'nın YNS cihazında kullanılabilmesi için geçmesi gereken bir dizi işleme kütüphane hazırlama [library preparation] deniyor.
Sekanslama işleminin gerçekleşmesi için her bir DNA dizisinin parçalanarak boyutunun küçültülmesi ve sekanslama ortamına sabitlenmesi/iliştirilmesi gerekiyor. Sekanslanacak DNA'nın boyu uzadıkça hem bazların okuma hassasiyeti düşüyor, hem enzimatik nedenli hata miktarı artıyor, hem de moleküller üzerindeki fiziksel stresin artmasıyla DNA veya üzerine bağlanan enzimler kopabiliyor. Bu nedenle birçok cihazın güvenilir okuma sağlayabildiği azami uzunluk 400-600 baz arasında değişiyor. Nanopore bu uzunluğu 5.000 baza kadar çıkarıyor ancak orada da sinyal kalitesindeki düşüklük nedeniyle okuma kalitesi düşük. Bu arada, her bir DNA parçasının sekanslanması sonucu elde edilen DNA dizilimine okuma [read] adı veriliyor.
Bu aşamada sekanslanacak DNA'yı kullanılacak teknolojinin izin verdiği boyutlara küçültmek için kullanılabilecek birçok yöntem var. Bunlardan günümüzde en sık kullanılanı transpozonlar ile DNA'yı parçalara ayırma. Bu yöntemde DNA, transpozonlar ile muamele ediliyor ve bu muamele süresinin uzunluğu ile ilişkili olarak DNA parçalara ayrılıyor. Tabii ki bu süreç tamamen homojen değil ve mevcut enzimlerin GC yoğunluğuna göre belirli yerleri kesme konusunda daha aktif oldukları biliniyor, bu nedenle başlangıçta kullandığınız DNA miktarı sonucu etkiliyor. Örneğin 50 nanogram insan genomik DNA'sı ile başlarsanız aslında yaklaşık 7.000 kopya ile başlıyorsunuz, bu çoğu zaman yeterli bir miktar. Bir diğer yaklaşım ise, hedef bölgelerin PCR ile çoğaltılması. Bu durumda PCR ürününüzün boyutunu siz belirliyorsunuz.
Uzunluğu ayarlanmış DNA parçalarının YNS cihazına yüklenmesi için bir aşamaya daha ihtiyaç var. DNA parçalarını bir yüzeye sabitlemek veya bir nanopora yönlendirmek için her iki ucuna da birer adaptör takmalısınız. Adaptör denilen şey aslında dizilimi önceden bilinen bir oligonükleotit. Bu adaptörler, kendilerine komplementer olan ve bir yüzeye sabitlenmiş oligonükleotitlere bağlanıyor: böylece sekanslanacak rastgele bölünmüş olan DNA'ların bir yüzeye yönlendirilmesi ve orada sabit tutulması mümkün oluyor. Bu aşamaya -tahmin edeceğiniz üzere- adaptör ekleme deniyor. Burada dikkate edilmesi gereken şey şu: kullandığınız YNS cihazı ve kullandığınız kitlere göre uygun olan adaptörleri seçmelisiniz. Hazır kitlerle çalışıyorsanız her şey birbiriyle uyumlu geliyor.
Kütüphane hazırlama aşamasının bitmesi için bir aşama daha var: indeks ekleme. Eğer tek bir örneği sekanslıyorsanız bu aşamaya ihtiyacınız yok, elinizdeki hazırlanmış kütüphaneyi doğrudan YNS cihazına yükleyebilirsiniz. Ancak birden fazla örnekle çalışıyorsanız ve kullandığınız YNS protokolü hedeflediğiniz toplam sekanslama miktarına uygunsa (mesela toplam 10 Mbaz'lık bir toplam okuma bekliyorsunuz ancak kullandığınız kartuş 500 Mbaz'a kadar toplam okuma miktarını destekliyorsa) bu durumda her bir örnekten elde edilen DNA'ların bir veya iki ucuna birden o örneğin belirteci olan 6-8 bazlık bir oligonükleotit daha ekleniyor. Tıpkı adaptör gibi, ilgili indeks belirteci de her DNA parçasının içerisinde yer alıyor. Her bir örnek için ayrı bir indeks belirteci kullanıp böylece her bir örnekten elde edilen DNA'ları işaretliyor ve ardından bunları tek bir tüpte karıştırıyorsunuz. YNS cihazından elde ettiğiniz okumaların başındaki bu parçalara bakarak her birinin hangi örnekten geldiğini de böylece belirleyebiliyorsunuz: bunu cihaza tanımladığınız takdirde YNS cihazı bunu sizin adınıza yapıyor.
Artık DNA örnekleriniz sekanslanmaya hazır. YNS cihazına bu örnekleri yükledikten sonra DNA parçaları cihazın kullandığı teknolojiye bağlı olarak bir dizi işlemden geçiyor ve sonuçta sizin elinize ham okuma verileri geçiyor. Bir sonraki aşamada bu verilerin nasıl işleneceği var, buna ilişkin süreçleri bir sonraki yazımda anlatacağım.
Sözün Özü:
Kullanılan YNS cihazı nasıl bir teknolojiyle çalışıyor olursa olsun, örneklerin cihaza uygun hale getirilmesi için bir dizi işlemden geçmesi gerekir, buna da kütüphane hazırlama denir.
Proje:
Parafin dokudan kütüphane hazırlamak için hazır kitler hangileri?
Meraklısına:
Yaygın olarak kullanılan Illumina Nextera XT kitindeki transpozonların GC yoğunluğuna göre heterojen bir kesme işi yaptığı uzun bir süredir biliniyordu. Ancak birkaç ay önce protein mühendisliği ile geliştirdikleri yeni bir enzimle bu problemin de üstesinden geldiler, yakında raflarda yerini alacaktır.